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分子实验介绍——印迹（Western blot）检测

通过SDS-PAGE凝胶将细胞或生物样品内的蛋白按照蛋白分子量从大到小规律分离开。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如纤维素薄膜或PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的起反应，再与酶或同位素标记的第二起反应（目前主要用HRP标记的第二），经过底物显色或自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分（目前主要使用鲁米诺和二抗中的HRP反应发出荧光，通过仪器或者胶片显色）。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了和包装信号，通过分子技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。

实验流程：细胞收集-细胞裂解，蛋白提取-蛋白变性-SDS-PAGE电泳-蛋白质转膜印记-蛋白封闭-目的孵育-二抗孵育-显色拍照

结果示例：

图 A不同大小的质粒转染细胞后，Western blot检测图片；B A蛋白不同培养时间后Western blot检测图片；C 使用Image pro plus软件对A蛋白灰度检测，A蛋白表达变化统计图

逆转录病毒构建及包装  

      逆转录病毒（Retrovirus）是一类RNA病毒。在逆转录酶的作用下，以病毒RNA为模板合成cDNA再通过DNA、转录、翻译等过程形成病毒颗粒。逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白表达系统，由逆转录病毒载体、辅助载体（表达病毒包装需要的蛋白质）和包装细胞系组成。逆转录病毒载体在外源基因表达、基因沉默、、生物制药等得到广泛的应用。逆转录病毒载体主要优点：转染范围广，可以各种细胞类型，转入的外源基因可完全融合，对细胞率高，细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。相对于传统芯片而言，RNA-Seq无需预先设计探针，即可对物种的细胞类型的转录组进行检测，能够提供较的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的良好工具。

     逆转录病毒载体系统共有两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了和包装信号，通过分子技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配，该病毒颗粒可其它宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的毒颗粒，保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。甲l基化特异性的PCRHerman等（1996）在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。

在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二焦碳酸酯为活性很强的物，须在通风橱中小心使用）

将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37℃ 或室温下处理过夜。

将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。

灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。

玻璃和金属物品250 ℃烘烤3小时以上。

活性氧检测试剂盒（Reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物（compound mixture），浓度为50mg/ml。2、DNA变性时，SYBRGreen染料释放出来，荧光急剧减少。

一、注意事项

1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。