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腺病毒包装原理介绍

腺病毒是一种没有包膜的直径为79-90nm的颗粒，由252个 壳粒呈二十面体排列构成。实验流程：细胞收集-细胞裂解，蛋白提取-蛋白变性-SDS-PAGE电泳-蛋白质转膜印记-蛋白封闭-目的孵育-二抗孵育-显色拍照结果示例：图A不同大小的质粒转染细胞后，Westernblot检测图片。每个壳粒的直径为7-9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，两端各有长约100bp的反向重复序列。***腺病毒 已知有33种，分别命名为ad1-ad33，研究详细得是ad2.

腺病毒是一种无包膜的球型结构的病毒，遗传物质为线型 双股DNA形式。腺病毒的特点：（1）gan染范围广对人致病性低；（2）对增殖和非增殖细胞均具有gan染性；（3）能有效进行增殖；（ 4）病毒滴度高；（5）不整合到染色体中，无插入致突变性；(6)外源***装载容量大。由于腺病毒的这些特点使其广泛地应用于体 外***转导、体内接种yi苗、和***zhi疗等各个领域。有丝分裂过程中DNA链之间的错配引起的fu制滑动被认为是导致STR产生的较为常见原因，并且依据不同fu制单元大小的不同以及不同物种之间，fu制滑动发生的概率也不相同。

实验方法

1.获得目的***序列；

2.构建病毒表达载体质粒；

3.表达载体质粒和包装质粒重组；

4.gan染HEK293，包装出病毒；

5.病毒扩增、浓缩；

6.滴度测定。

分子与质粒载体构建

实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。如今有多家公司推出了外显子组捕获***，包括罗氏NimbleGen、安捷伦、Illumina，还有现在的华大***。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛碱性磷酸酶)CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

单细胞RNA测序

单细胞RNA测序也称scRNA-Seq。通常而言，一般的***细胞RNA-seq实验会产生1000万个读数，如果一个***的频率超过50RPKM，即每百万读数中每千个碱基中超过50个，这一***即被认为有表达。泊松分布下，1kb长的***有超过500个读数和4%的小变异系数，即CV值；哺乳动物细胞通产含有200,000个mRNA，因此至少要用50个单细胞一起才能到达小CV值；考虑到逆转录的效率和环境干扰等因素，为得到准确的表达和细胞种类的识别，需要使用的细胞数量实际要更多。目前主要使用Sybrgreen和taqman法对RNA含量进行检测。