辽宁流式细胞常用指南「英瀚斯」

细胞实验介绍——慢病毒建立稳转细胞系

慢病毒包装：公司使用3质粒慢病毒包装系统，慢病毒系统使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至HEK293T细胞中，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒颗粒纯化***盒将慢病毒纯化。纯化后留取部分检测病毒滴度，其余病毒冻存于-80℃冰箱中。分离和富集精原gan细胞成为精原gan细胞体外培养能否成功的前提条件。

滴度检测：将病毒颗粒使用梯度稀释，分别293T细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。

细胞：在病毒前一天对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释病毒，加入12孔板中对细胞进行，病毒数量根据推荐细胞的MOI加入（若无推荐MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5个梯度对细胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量PCR和Western blot检测目的***的稳定表达情况。3D细胞培养3D多细胞肿liu球是在体外应用***培养方法使肿liu细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。

实验流程：慢病毒质粒构建-HEK293T细胞培养-质粒转染293T细胞-病毒收集-病毒纯化-病毒滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例：

                                               图 A 病毒滴度检测；B 目的细胞病毒效果图

细胞生物学服务

  南京英瀚斯生物科技公司自建有标准的细胞培养房，配备有生物安全柜、超净工作台、细胞三气培养箱、二氧化碳细胞培养箱、荧光倒置显微镜、体视镜、、流式细胞仪等设备。细胞组技术人员毕业于东南大学、华中科技大学等高校生物学相关，具有硕士研究生以上学历，熟练掌握细胞学相关实验，可开展多种细胞实验。动物实验外包选英瀚斯生物科技有限公司。自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

脂质体瞬时转染

1、细胞H9C2 (Hela) 6孔板Hela1x10°/孔。

2、转染前换上没有抗sheng素的DMEM+胎清(10%)。

3、将质粒DNA (约2-4ul) 2ul 加入dorf管中+DMEM至50u1。

4、脂质体5ul补培养基至50ul混匀静止5分钟(质粒与脂质体比例为1:2或1.5:2.5)。

5、将含有脂质体的培养基与含质粒的混合总体积100ul室温放置30分钟。

6、吸取混合物均匀加入每一个孔中。

7、将6孔板放入培养箱中继续培养6小时后吸出培养基换上新配置的培养基DMEM6ml+胎清600u1+三抗300u1。

8、培养24小时。