293t细胞RNA水平「英瀚斯」

细胞培养中常见的污染及解决方法

霉菌污染

正常情况下，培养基在 37℃ 培养箱中培养两三天，在倒置显微镜下仍保持透明，无杂质。一旦出现絮状杂质，显微镜下可见丝状和团块状漂浮物，菌丝明显。此时，虽然细胞仍在生长，但它们的生命状态会在长时间后逐渐恶化。

解决方法：用***铜溶液擦拭 CO2 培养箱，向托盘中加入饱和***铜或消毒后加入饱和磷酸氢二钠高盐溶液，避免霉菌污染。

如果霉菌污染，暂时转移所有细胞，并立即使用 guo 氧擦拭培养箱，包括层板和内壁。(4)缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面,保持二者分层界面。将 guo 氧放在培养箱中一小时，使蒸汽扩散，待 guo 氧气味消散后，将细胞转移到培养箱中。值得注意的是，培养箱需要每两个月定期清洗一次，尤其是在梅雨季节。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精连续擦拭培养箱，用紫外线照射也是一种有效的方法。

为防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 、***素、fang

线菌素 D 或青链。一旦被污染，就不可能***，即使使用上述，也没有什么区别。G，过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2。对于支原体污染的细胞培养，选择是丢弃污染的培养物，并用使用新鲜的无支原体的储存液，消毒环境。如果所有的细胞都被污染了，那可能是整个培养系统污染了。因此，必须对培养基和实验设备进行检查。如果只是个别污染，可能是操作问题，有必要注意实验操作步骤的规范。

支原体污染

支原体是隐蔽的污染物，不能通过过滤去除。显微镜下没有任何可见的支原体污染迹象，比如细胞病变和浊度或 pH 值变化（即使在严重污染的培养基中），这样就会导致我们产生错误的安全感。而在牛中，支原体是常见的微生物之一。

解决方法：通常的过滤灭菌方法对支原体没有影响。细胞一旦被支原体污染，特别是对重要的细胞系，必须去除支原体，一般的方法有、抗和抗与补体联合。实验流程：慢病毒质粒构建-HEK293T细胞培养-质粒转染293T细胞-病毒收集-病毒纯化-病毒滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定结果示例：图A病毒滴度检测。值得注意的是，支原体很突出的结构特征是没有细胞壁。因此，它对作用于细胞壁的生物合成（如 β-内酰胺类、万古等）完全不敏感，并且通常对多粘菌素、利福平和类具有耐药性。相反，四环素类和大环内酯类对支原体的***作用很强，而氨基糖苷类和氯的***作用较弱。

细胞冻存有哪些注意事项？

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。通常改变***ES细胞不分化状态的培养条件,ES细胞就可以分化成多种细胞类型。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是的。

细胞冻存的步骤：

配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛的冻存培养液;

取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用 PBS 清洗。

去除 PBS，加入适量胰蛋白酶 (覆盖培养皿表面) 把单层生长的细胞消化下来;

离心 1000rpm，5min;

去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的终密度为 5×106/ml~1×107/ml;

将细胞分装入冻存管中，每管 1~1.5 ml;

在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;

冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿liu药wu筛选、细胞毒性试验、以及肿liu放she敏***测定等。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。