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动物***细胞***组DNA提取

操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物***块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见***块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K

（500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另

一离心管中。

2.加2倍体积异，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

3.加等量的酚??振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的?，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。

10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

甲l基化特异性的PCR

Herman 等（ 1996 ）在使用重亚***盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏***高，主要用于作定性研究。用亚***氢盐处理***组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不变；随后设计针对jia基化和非jia基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后jia基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在jia基化；反之，说明被检测的位点不存在jia基化。MiRNA是一类可以通过RNAi机制调节***表达的内源性小RNA，人工miRNA与shRNA的设计原理基本相同，由于miRNA具有内源性，因此其更易产生有效的***沉默。

特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生jia基化。

亚***氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

亚***氢盐修饰后测序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA jia基化方法，此方法可靠性及jing确度高，能明确目的片段中每一个 CpG 位点的jia基化状态。用亚***氢盐处理***组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧ding被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，***后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生jia基化，称为BSP-直接测序法。另一个加入Opti-MEM、lipo2000，然后将两管混匀。将PCR产物克long至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-ke隆测序法。

特点：jing确度高，能够准确检测出jia基化的程度百分比。

染色质免l疫共沉淀技术(ChIP)

基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析Chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, ChIP)技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活l细胞或者***的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与***表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。二、大肠菌群检验方法:由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的***，即:需氧及兼性厌氧、在37°C能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞。采用结合微阵列技术在染色体***表达调控区域检查染色体活性,是深入分析***l症、心血l管病以及******系统紊乱等***主要通路的一-种非常有效的工具。

染色质免l疫沉淀分析(ChIP) 的基本原理是在活l细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内，当F与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNAl片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36士1°C培养18-24h，观察菌落形态。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。